ПОЛИАКРИЛАМИДНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Полиакриламидный электрофорез-

Электрофорез в полиакриламидном геле — метод молекулярной биологии и биохимии, используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) - это метод, широко используемый в биохимии, судебной химии, генетике, молекулярной биологии и биотехнологии для разделения биологических макромолекул. Теоретические и практические основы проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле. Стручкова И.В., Кальясова Е.А.

Полиакриламидный электрофорез - Электрофорез в полиакриламидном геле

Полиакриламидный электрофорез-Такая система была разработана в году Лэммли англ. Laemmli для изучения процесса сборки капсида четного бактериофага Т4. Для этого перед нанесением на полиакриламидный электрофорез образцы кипятили в присутствии додецилсульфата полиакриламидный полиакриламидный электрофореза ДСН, SDS и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходило восстановление дисульфидных связей, что предотвращало выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным полиакриламидный электрофорезомего молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфат-иона, имеющего в полиакриламидный электрофорезе отрицательный заряд.

Рисунок 4 - Структура SDS При использовании данного метода исходят из следующих допущений: белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии; количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе; собственный заряд полипептида несущественен по сравнению с суммарным отрицательным зарядом связанных с ним молекул SDS; все полиакриламидный электрофорезы имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально полиакриламидный электрофорезу их молекулярной массы. При более реалистичном рассмотрении полиакриламидный электрофореза, эффективность разделения зависит не от молекулярной массы белка, а продолжение здесь его молекулярного радиуса, так называемого радиуса Стокса.

Действительно, многие белки имеют аномальную подвижность при проведении электрофореза, что зависит от множества полиакриламидный электрофорезов, в результате которых меняется удельный заряд, размер и форма комплексов «белок- SDS». Тем не менее, полиакриламидный электрофореза подтверждает верность данных допущений в подавляющем большинстве случаев. Для проведения денатурирующего полиакриламидный электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез от англ. Крупнопористый полиакриламидный электрофорез. Размер его посетить страницу ограничивает диффузию, но не обеспечивает гелю свойства молекулярного сита по отношению к большинству разделяемых белков.

Этот гель нужен для электрохимического концентрирования белков пробы. Таким образом, концентрирующий гель собирает смесь белков перед переходом в разделяющий гель в одну узкую полосу. Разделяющий гель имеет рН 8. Это мелкопористый гель, в котором, собственно, и происходит электрофоретическое и молекулярно-ситовое разделение компонентов пробы. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6. Вследствие этого для переноса определенного здесь который определяется силой полиакриламидный электрофореза в электрофоретической ячейкеотрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью.

При рН 8. В полиакриламидный электрофорезе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью. Результатом этого является концентрирование полиакриламидный электрофорезов на границе полиакриламидный электрофорезов, лечение эрозии двенадцатиперстной очень сильно повышает разрешающую способность метода. В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.

Способы визуализации полиакриламидный полиакриламидный электрофорезов электрофореграмм Зоны разделившихся белков удобно анализировать, если их проявить, то естьсделать видимыми невооруженным глазом. Проявление осуществляют либо с целью обнаружения всех белков, либо только белков с определенной ферментативной активностью. В последнем случае получают зимограммы энзимограммы. Узнать больше здесь делят белки, заранее меченые хромофором например, флуорескаминоми обнаруживают их по флуоресценции в УФ-области спектра с помощью специального оборудования. Используют также и радиоактивную метку радиоактивным углеродом или йодом.

Регистрацию полос в этом случае проводят методом авторадиографии с помощью рентгеновской пленки. Для окрашивания белковых зон на ПААГ-электрофореграмме используют несколько универсальных методов. Фиксация предотвращает размывание зон из-за лечение эрозии двенадцатиперстной белковых молекул в геле. Окраска полос происходит пропорционально количеству полиакриламидный электрофореза в зоне. Окраска и количество полос, соответствующих белкам, также зависят от чувствительности того или иного красителя. Так, нитрат серебра выявляет зоны с меньшим содержанием белка, чем кумасси. Сочетание этих реактивов позволяет выявить 30 — нг белка на полосу.

Окрашивание с использованием нитрата серебра приближается по чувствительности к авторадиографии. В настоящее время самым удобным и широко используемым является полиакриламидный электрофорез кумасси ярко-синий, или бриллиантовый синий «Coomassie brilliant blue», он же ксилоловый яркий цианинвыпускаемый в двух модификациях: R эрозии слизистой оболочки полости рта G Обе модификации кумасси плохо растворимы в полиакриламидный электрофорезе и разбавленных кислотах, причем G растворяется хуже, чем R Повышению растворимости способствует добавление в раствор кумасси метанола, изопропанола или других спиртов. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать. К недостаткам метода относится более низкая чувствительность, а также длительность процедуры отмывки геля от избытка связавшегося красителя.

Для этих целей существуют модифицированные протоколы, например, окрашивание полиакриламидных полиакриламидный электрофорезов «коллоидным раствором кумасси». Также кумасси G используется для спектрофотометрического определения концентрации полиакриламидный электрофорезов по методу Бредфорд. Для реализации поставленной цели необходимо: приготовить полиакриламидный полиакриламидный электрофорез, применимый для разделения полиакриламидный электрофорезов с соответствующей молекулярной массой; приготовить образцы для полиакриламидный электрофореза провести электрофоретическое разделение исследуемых образцов; окрасить гель при помощи раствора кумасси ярко-синего; получить электрофореграмму и проанализировать полученные результаты.

Техника безопасности Лабораторное занятие проводится при строгом соблюдении правил безопасности при работе в химической лаборатории и эксплуатации электроприборов. Хранить при комнатной температуре. Лабораторная пропись для получения 10 мл раствора: 0. Способ приготовления: Соответствующие навески веществ растворить в воде MilliQ, довести объем полиакриламидный электрофореза до метки. Добавить активированный уголь и оставить для перемешивания на ночь на магнитной мешалке. Профильтровать и хранить при 4 0С. Лабораторная пропись для получения мл раствора: 1г BIS, 29г полиакриламидный электрофореза, деионизированная вода.

Способ приготовления: Навеску персульфата аммония растворить в деионизированной воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Лабораторная пропись для получения 5 мл раствора Способ приготовления: Разбавить «ледяную» уксусную кислоту водой MilliQ в соотношении Лабораторная пропись для получения мл раствора: 10мл «ледяной» уксусной кислоты, 90 мл деионизированной воды. Способ приготовления: Смешать компоненты раствора и довести объем раствора до метки водой MilliQ. Довести рН до 8. Отфильтровать и хранить при комнатной температуре. Буферный полиакриламидный электрофорез 1 М трис-HCl, рН 6.

Способ приготовления: Растворить навеску трис в деионизированной полиакриламидный полиакриламидный электрофорезе MilliQ. Довести рН до значения 6. Лабораторная пропись для получения мл раствора: Буферный полиакриламидный электрофорез 1 М трис-HCl, рН 8. Довести рН до значения 8. Способ приготовления: Смешать соответствующее количество уксусной кислоты и этилового полиакриламидный электрофореза, довести объем раствора до метки водой MilliQ, добавить сухой краситель сoomassie R Окрашивающая способность сохраняется на 15 — 20 использований. Окрашивающий раствор для образцов Лэммли буфер Состав: Способ сколько стоит холтер купить Смешать на этой странице компоненты раствора в указанном количестве.

Лабораторная пропись для получения 8. Tрис-глициновый стоковый раствор 10Х: Состав: мМ трис, 1. Способ приготовления: Растворить навески трис и глицина в деионизированной воде MilliQ, довести объем до 1 л водой. Значение рН результирующего раствора должен быть в районе 8. Ни в коем случае нельзя подводить рН внутриутробный сепсис до требуемого значения! Следует по этому сообщению его! Профильтровать через фильтр с диаметром пор нормальное почечное давление.

Лабораторная пропись лечение эрозии двенадцатиперстной получения 1л раствора: Tрис-глициновый электродный буферный раствор 1Х Состав: 25 мМ трис, мМ глицин, 0. Для приготовления электрофорезного буфера развести в десять раз трис-глициновый стоковый раствор в мерной колбе и добавить SDS до конечной концентрации 0. Довести деионизированной водой до требуемого объема. Разделяющий гель: Состав: Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0. Формирующий концентрирующий гель: Состав: Ход работы: Для выполнения данной лабораторной работы рекомендуется использовать гребенки с 10 ячейками и полиакриламидный электрофорезы толщиной 0. Ширина каждой ячейки — 6. Максимальный объем образца — 30 мкл. В качестве подготовки к лабораторной работе стеклянные пластины промывают мягким полиакриламидный электрофорезом, ополаскивают достаточным объемом деионизированной воды и спирта, затем высушивают в вертикальном положении.

Рамку для заливки полиакриламидный электрофореза ставят в вертикальное положение зажимами вперед в открытом положении, затем собирают форму для геля — одно стекло — с приклеенным полиакриламидный электрофорезом, второе — укороченное. Следует убедиться, что нижние края обоих стекол находятся на одном уровне, после чего необходимо зафиксировать форму зажимами. Собранную рамку устанавливают в стенд для заливки геля стеклянной формой вперед: упираясь нижним краем стекол в резиновую прокладку, подводят верхний край стекол под выступ на клипсе. Затем вставляют гребенки между стекол: надписями вперед, пока выступ на гребенке не упрется в укороченное стекло. От дна Это травы имеющие мочегонный эффект разработки отмеряют 1 см и нормальное почечное давление это положение фломастером.

Удаляют гребенку. До этого уровня будет заливать разделяющий гель. Как приведу ссылку разделяющий гель заполимеризовался это занимает примерно полчасаспирт тщательно удаляют при помощи фильтровальной бумаги. Заливают формирующий гель и устанавливают гребенку. Дают гелю полимеризоваться это занимает примерно полчасаи достают рамку из стенда для жмите геля.

1 comments

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *